[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Rozdzia3.2.4
B|oting
biaek
Andrzej Kozik, Ibeth Guev ara-Lora
jako
,,bloting,',
zyska'aw ostat.
nich latachrangrunowego
postpowania
umoliwiajcegoposzerzenie
zakresu
zastosowa
elektroforecznych
rozdziaw kwasw nukleinowych i biaek. Po
wykonaniu zwyl<ejelektroforezy
w zelu
polialoamidowym
lrrb agarozowym'
zamiastwykrywa(wybarwiac)
rozdzielonebiopolimerybezporedniow elu,spo-
rudzasi najpierwkopi ptki elowejna
odpowiedniodobranejbonie.W tym
celu wymusza si
przejcie
rozdzielonychsubstancjiz |una bon,
na ktrej ule-
gajone mocnej,zwykle nieodwracalnejadsorpcji.Zakes dalszegopostpowania
z takreplikrozdziau
jest
odmiennyni
postpowania
Z Samymze|mdo elektro-
forezy.W szczeglnoci,naturachemicznabonydo blotingu
umoliwiazastoso-
waniewielu dodatkowych,cennychmetoddetekcjirozdzielonychsubstancji.
W rczdziale niniejszym omwione swycznietechniki blotingu biaek(ang.
Westernblotting).Wyszczeglniono
podstawoweproblemypraktyczne,jakie
nale-
y brac pod uwag dobierajcproceduroptymalndla konlaetnej,
badanejmie-
szaninybiaek.
stosowanesbony:nitrocelulozowe,poliwiny-
lidnowe
(PVDF'
ang.
polyvinylidene
difluoride)oraznylonowe' Adsorpcjabiaek
do tych bon opiera si w znacznejmierz na oddziawaniachhydrofobowych.
W przypadkach,gdy nie mozna sobie pozwoli
na
nawetminimalne
stratybiaka
przy przenoszeniuna bon,stosujesi czasem bonyz DBM (ang. diazobenry-
loxymethyl) lub DPT
(ang'
diazophenylthioether),do ktrych biakawizsi
ko-
walencyjnie.
Spordtrzechnajpopularniejszych
typw bondo blotingu biaek,nwyisz
pojemnowizania wykazuj bony nylonowe, a najnisz_
bony
PVDF. Para-
tnetrten,wyraanyzwykle
jako
iloalbuminy,zaadsorbowanejprzez 1 cm, bony
po
cile
transferze,podawany
jestprzez
producenta.
ale atwo mozna
go
wyznaczy samodzielnie. Przykadowo,
popularne
filtry nitro-
celulozowe
do blotingu biaek
maj
pojemno
wizania w za|<resie80-100
1lglcmf
jest
wielkoporowbony(0,1;0,2lub 0,45
pm).
Bonyo ma-
ychporachnadajsi do blotingu stosunkowomatychbiaek
(np.
bonyo porach
0,2
trlm
dla biako masachczsteczkowych
poniej
20 kDa).
BonyPVDF wykazuj
wyzsz odporno mechaniczn
oruz niiszwrazliwo
na dzia.anie
rozpuszczalnikw organicznychni bonynitroclulozow i ny1onowe'
Da|szza|etbon
PVDF
jest
to,
ie ich wybarwieniestandardow
procednrz
za-
74
Technika,
okrelanaw argonielaboratoryjnym
Bony do blotingu
Do blotingubiaeknajczciej
okrelonym,
,,Standardo.wym''
' Innym waznymparametrem,rzutujcymna wydajnoprzeniesienia
bia-
ka z |una bon,
iaek
stosowaniem
bkitubrylantowego
Coomassie
nie
wyklucza
dalszego typowego
postpowania
-
immunodetekcji
|ub analizy
sekwencji
aminokwasowe].
Transfer biaek
z eluna
bon
Rodzaj
e elektroforezy, p
oprzedzaj
cej
bloting
W zasadzie wikszo
typw
wysokorozdzie|czej
elektroforezy
biaek,w e-
lach poliakryloamidowych
lub agarozowych
uformowanych
w
cienkie ptki,
mo-
na uzupeni
technikamiblotingu.
Najczciej
bloting pizeprowad,u
,i-, elipo-
liakryloamidowych
po
jednowymiarowej
elktrofore
a-Lora
zi
w becnoci
doiecylosiar-
czarlu sodu (SDS-PAGE)'
Istotny postp
w
zastosowaniach
tej techniki przynioso
wprowadzenie zminiafuryzowanych
apuatw, pozwalajcych
a
zmirunittiowanie
czasuelekkoforery,Utywane
w
tych aparatachmini-ele
'
ostat-
akresu
:k. Po
)wym,
l, spo-
il tym
ej ule-
rwania
lektro-
rstoso-
(oprzykadowych
wymiarach
7 cmx 10 cm x 1 rnm)
idealnienadaj
si do blotingu'
gdyzcienkiej
matrycy
elowej
biakaatwowychodzna
bon'
Elekhoforetyczne
metoy o rekordowejiozdzielczo.
ci,
takie
jak
dwuwymiarowa
PAGE (ogniskowanie
izoelektrycznw piirwszym
kie-
nmku'
SDS.PAGE
niej
jest
wykona
repliki nabonach.
Podstawowe
ukady do
transferu
W najprostszymprzypadku
kansfer rozdzie7onych
substarrcj
Y.d*g*)
wymagaj
zastosowania
wikszych e|i,
zktry;h trud-
i z
ie|una bon
odby-
wa si
pod
wpwem
si napiciapowierzchniowego
buforu
(wznoszenie
kaprlame;'
Jestto tzw.
hansferswobodny'
ktregoschmatprzedstawiono
na
rysunku
1.
:
(ang.
: nale-
j
mie-
8
--|
iwiny-
biaek
wych.
biaka
)enzy-
i ko-
6-*
,ysz
Para-
bony
centa.
nitro-
0-100
r bia-
o ma-
'orach
jego
przeniesinie
na
bon
nie
jest
wymagane(bloting
przeprowadza
si wycznie
* .t.' ana|izy
jako.
ciowej)'Najczciej
jednak
przechodzenie
biaekz ze\una bon
*ymusza
si
przez przyozeniepola
elektrycznego
_
procedura
ta nosi nazw
elektrotransferu,
lub transferu
lektroforcznego,
Stosujesi dwie
zasadniczewersjeelektrotrans.
feru
_
,,mokry''
lub
,,psuchy''.
Pierwszz
wmienionych
procedui
wykonuje
si
w naczyniu
wypenionymbuforem (rys.
2). Wersja psucha
polega
na oboeniu
iwo
nowe.
z za-
75
Rys, 1, Schemat ukadu
do transferu swobodnego
biaek.]
_
zbiornik
z buforem, 2
-
pta
szklana,
3_cznikzbibuy./iltracyjnej,4_elpoelektroforezie,5_bonadoblo"tingu,6_itszebibuy
filtracyjnej,
7
_
rczniki celulozowe,
8
_
pyta szklna,
9
-
przycisk,
Do blotingu
biaekstosuje
si
go
np' przy sporzdzaniu
replik elipo
ognisko-
waniu izoelektrycznym (biatka
po
takirn rozdzia|enie
maj adunku),
albo
gdy
ilo
biakaw elupo elektroforeziejest
duia,. a ilociow
pomidzy
dwima
pytowymielektrodami
(np.grafitowymi)
o
ch
samych
wymiarach. Ten typ elektrotransferu
jest
zwykle tanszy i krtszy ni
transfer
mokry i idealnie nadaje si do zeli
poliakryloamidowych, stosowanych
w zminiaturyzowanychaparatach.
Jednakw stosunkudo elipoliakryloamidowych
o wikszych wymiarach
i stzeniachw zakresie 10-20
o,
charakteryzujesi z
re-
guy
niszwy
dajno
ci
przeniesienia biak.
o
Rys, 2. Schemt urzdzenia do mokrego elektrotransferu
biaek' I- rdoprdu, 2
_
komora z
buforem,3-noda,4-katod,5-warstwybibuy,6_el,7_bonadoblotingu,8-kaset
chodzca,
Wan za|ettransferu
psuchego
jest
mozliwozastosowanianiecigego
ukadubuforw,
tj.roznychbuforw po stroniekatodyi anody
(patrz
niej).
Producenci
wyposazenia do elektroforezy oferuj urzdzeniado elektrotransfe-
ru dopasowane
do rozmiarw eli stosowanychw aparatach
do
lektroforezy
tej
samejfirmy.
Czynniki
wpywajcena wydajnotransferu
Na wydajno
przeniesieniabiaekwpwa ptzede wszystkim skadbuforu'
w ktrym
zachodzj
proces
elektrotransferu.optymalny
skadpowinien by ustalo-
ny dowiadcza|nie.
76
kanapki
e!-bonakilkoma warstwami nawilonej
odpowiednim buforem bibuy
oraz
ciniciu
caoci
Za|ezy on od typu elu
(rozmiary elupoliakryloamidowego,
stenieakrylamidu),natury
przenoszonychbiaek(wielkoczsteczek,
ich adu-
nek elektryczny,
stopie potranslacyjnejmodyfikacji takiej
jak
np.
glikozylacja),
typu bony
itd. Podstaw
jest
zwykl bufor Tris-glicyna, zawierajcY
szeregdodat-
n bibuy
towymi)
3tsry ni
rwanych
idowych
si z re-
pcznieniuelu(co pocigaoby
za sobrozmywaniepasm
biakowych)
ofaz wspomagaadsorpcjbiaekna bonachnitrocelulozowych
i PVDF, zsryaszcza
w
przypadku
biaek o maejmasie czsteczkowej'Ten
wpyw metanolu tumaczy
si wzmacnianiem
oddziawa
hydrofobowych midzy
czsteczkamibiakaa bo.
n.
Metanol uatwiaponadto
dysocjacjkompleksw biaekz SDS,
zktrych zwy-
kle startuje
procedura
transferu.Jednakw przypadku
duychbiaekmtanol
moie
prowadzido ich denaturacji,a tytn samym obnizenia
wydajnociprzeniesienia.
Niektre
biakamog wrcz precypitowa
w elupod wpwem
metanolu.Jeeli
bloting wykonuje si na bonPVDF w celu dalszej
ana|izyskadulub sekwencji
amirtokwasowej,dodatekmetanolu
jest
niekorzystnywobec
moliwocimodyfika-
cji chemicznejbiaka
ptzez
ten odczynnik' Jest to zarazemprzykJad
sytuacji,gdy
buforem
podstawowymnie
moeby Tris-glicyna (ze wzg|duna obecno
ami'
nokwasu
glicyny)
_
odpowiedni
moebyc wtedy np' bufor
CAPs_3.(Cyc1ohexy.
lamino)-
1
-propanesulfonic
acid.
Niezalenieod
pu
elektrofor
zy, poptzedzajcej
bloting,
czstona etapieelektrotransferu
stosujesi bufor z dodatkiem
SDS, ktory
zwikszaprdko
przenoszeniabiaekz
z|una bon,ale z drugiej
stronyosabia
wizaniebiakado bony.Szczeglnie podana
jest
obecnoSDS (zwykle
w st.
w buforzedo elektrotransferupo rozdzidre
biaekmetodogniskowa-
nia
izoelektrycznego,gdy
detergentten nadaje biakom adunek
,co
znacznie
zwiksza
ich ruchliwoc'
Tab,
]
' Standrdowe ukadybuforowe wykorzyswane w elelctrotransferze
biaek
TYP
elektroforezy
Tvp
transferu
Ukad
buforowv
Bufor anodowv
Bufor katodowy
SDS-PAGE/
ogniskowanie
izolektrvczne
Mokry
Cigty
25mM Tris,pH 8,3,
192mM glicyna,
10%metanol
25
mM Tis,
pH
8,3,
192mM glicyna,
l0% metanol
I:300mM Tris,
pH
10,4,
1O%rnetanol
II:25mM Tris,
pH
10,4,
l0% metanol
komora z
-
kaseta
SDS-PAGE
Psuchy
Niecigy
4 mM
kwas6-
aminoheksanowy,
pH7,6,
10%rnetanol
:igego
I:
300mMTris,
pH
10,4,
II:100mM Tris,
pH 10,4,
10%metanol
100mM arginina,
pH1,6,
0,01%
sDS,
l0%
metanol
transfe-
re4t tej
Ogniskowanie
izoelektryczne
Psuchy
Niecig
transferu.Przykadowo,dodatek
SDS
do buforukatodowegosprzyjamigracji czsteczek
biakaw kieruu bony,nato-
miastmetanolobecnyw buforzeanodowymuatwia
dysocjacjkompleksw SDS--
-biako
iwzmacniawizanie biaekdo bony'
Wydajnoelektrotransfru
za\y tez od czasu
jego
przeprowadzenia.
W razi
przeduenia
buforu,
ustalo-
Lowego,
;hadu.
ylacja),
I
dodat-
transferumoze nastpowadesorpcja
biaekz bony i ich
przenoszeniedo dalszych
warstwbibu. Dlatego optymalnyczas transferu
naley
okrelidowiadczalnie.
77
kowych
skadnikw(tab.1).Przykadem
takiegododatku
jest
metanol,
ktry prze-
ciwdzia.a
nJ;.l0,010)
W techniceelektrotransferupsuchego
monadobiraniecige
ukadybufo-
rowe szczegolniekorzystnedla
efektywnoci
transferu,wpwa
m.in.natenieprdu.
Zbyt
wysokie powoduje,eukad
wymaga chodzenia,a
ponadtomoze spowodo-
waspadekwydajnoci
transferubiaeko niskich
masachczsteczko\\rych.
Wykrywanie
biaekzaadsorbowanych
na bonie
Bezporednie
wybarwianie
wszystkich
pasm
biakowych
Niespecyficznewybarwianie
wszystkichprkwbiakowych
wykonuje sinp.
w celu ana|izy
oglnej efekwnocitransferu
lub w celu odniesieniainteresujce-
go
sygnafu
wzgldeminnych
biaeknp.markerwmasy czsteczkowej.
Do trwaego
(nieodwracalnego)wybarwiania bon
nitrocelulozowychi PVDF na-
daje si szereg
barwnikw organicznychtakich,
jak
bkitbrylantowy Coomassieczy
cze amidowa.
Wyzszczuoci
charakteryzujesi barwienie srbremalbo
kolo-
idalnym
zfotem' ostatnia z wymienionych
metod pozwala
lvykry poniej 100 pg
biakaw
pamie.Nieodwracalnowybarwiania
tymi metodamiw wielu
przypadkach
wyklucza dalsz
postpowanienp. immunodetekcj.Wspomnianym
ju
wyjtkiems
biakaprzeniesione
nabonPVDF i wybarwione
bkitemCoomasssie.
Jednym z nuzyteczniejszych
barwnikw
jest
PonceauS. Jego oddziawanie
z biakami
jest
atwoodwracalne
-
po
wybarwieniu
bonyi zaobserwowaniu
pr-
kw biakowych
(i
ewentualnie delikatnym
ich zaznaczn|u),
mona szybko od-
barwi
bonprzez
przepukiwaniewod po czym
przystpido dalszychbardziej
specyficznych sposobw
ana|izy' Innym, rzadziej stosowanym
barwnikiem,
po-
zwa|ajcym
na odwracalneniespecyftczne
barwieniebiakna bonach
po blotingu
jest
CPTS
(ang.copper
phthalocyaninetetrasulphonicacid)'
Wykrywanie
za pomoc swoistych
przeciwcia (immunobloting)
Ten zdecydowanie
najpopularniejszytyp
blotingu biaek
jest
wykonywany
w rozmaitych
wersjach,roznicychsi
stopniemkomplikacji ukadu
detekcyjnego
(rys. 3) oraz natltkocowego
sygnauanalicznego,
umoliwiajcegozaobser-
wowanie
pasmbiakowych.
Po transferze
nale najpierwzablokowa
woln
powierzchni
na bonie'
Jako
roztwory
blokujcestosuje
si najczciejodtuszczorl
mleko (I-5%) lub roztwr
albuminy surowicy
bydlcej (0,5-3%).Nastpniebon
inkubuje si w roztworz
przeciwciaa'
swoistegowobec wykrywanego
biaka.Po odmyciu nadmiaru
prze-
ciwciaa,
przystpujesi do kolejnych etapw
analiry,ktorych ostatecznym
clem
jest
wprowadznie
w miejsce,
gdzie znajduje si wykrywane biako,
znacznika
umoliwiajcego
wizua|tzacj
pasmai, ewentualnie,oznaczenie
ilocitego skad-
nika
w pamie.W najkrotszej
z procedur,przeciwciao'bezporednio
oddziaujce
z
angenem zaadsorbowanym
na bonie, samo zawiera
juz
znacznik analtczny,
Niestety,
jest
to
wersjakopotliwai kosztowna'
Przeciwciaoto,
jako
swoistewo-
bec konkretnego,
wykrywanego biaka'
jest
unikalie, a zatem kosztowne.
Jego
znakowanie
pocigaza sobnieuchronne
straty,a
ponadtota chmtcznaprocedura
z regu musi by wykonana
we wasnymzakresie.
Wygodniej i taniej
jest
posfu-
iyc sihandlowo
dostpnymt
ju
wyznakowanym
przeciwciaem(okrelanym
78
Na czas,
a|tez i zarazm
na
jako
ja.
ko
,,drugorzdowe''),
skierowanym
wobec typu
przeciwciaa,uytegodo
pierwot-
nej reakcji z angenem
na bonie
(przeciwciaa
,,pierwszorzdowego'').
Przyka.
[ Pobierz całość w formacie PDF ]