[ Pobierz całość w formacie PDF ]
©MikołajGołuńki
Opracowaniezagadnieńdotematu„blotting”
nazajęciazbiochemii
InżynieriaBiomedyczna,MSIB,AGH
semestr letni 2011/2012
Wszystko gdzie nie ma podanego źródła pochodzi z wikipedii. Tym razem nie ma do-
starczonych zagadnień więc opisuję to co wydaje mi się, że może być oraz to co nie
widziałem czym jest.
Spis treści
1.
Western blotting........................................................................................................................................ 2
1.1.
1.2.
1.3.
2.
Inne ......................................................................................................................................................... 3
Strona
1
z
3
JedynienawewntrznyużytekkierunkuInżynieriaBiomedyczna,MSIB,GH.
 ©MikołajGołuńki
1.
W
ESTERN BLOTTING
Metodaanalitycznapolegającanapoczątkowymrozdzieleniumiezaninybiałek(zdenaturo-
wanych - wedługmay,niezdenaturowanych- wedługtruktury3D)wżelu w procesie elektroforezy,
natpnieprzenieieniu(elektrotraner)rozdzielonychbiałeknamembranpolimerowąanakoniec
wybarwienie interesującychbiałek.Procejetchematycznieprzedtawionyponiżej.
1.1.
Elektroforeza
Technikaanalitycznapolegającanarozdzieleniumiezaninyzwiązkówchemicznychnafrakce
poprzezwymuzenieprzemiezczaniaczątekwpoluelektrycznym.
Ruchliwoćelektrooretycznaczątekjetwprzybliżeniuproporcjonalnadoładunkuelek-
trycznego i odwrotnieproporcjonalnadojejwielkoci.Zależyteżodkztałtucząteczki.
Orodkiem,wktórymprzeprowadzanajetelektroorezamoże
byćżel(wtymprzypadkuzpoliakrylamiduprzedtawionegoobok).Żel
uormowanyjetzwyklewpłytkodługocikilkunatu-kilkudzieiciu
centymetrów.Kroplubtancjinanoiiwewgłbieniazwanetudzien-
kami. Końcówkalbocałąpłytkzanurzaiwroztworzebuoraprzewo-
dzącegoprąd.Powłączeniunapiciacząteczkibadanegoroztworumigrująwgłąbżeluorazdalej
poprzezżelrozdzielającinate,któreporuzająizybciejitewolniejze.
1.2.
Elektrotransfer
intrukcjadoćwiczeniaWtymprzypadkuprzenieieniebiałekzżelu,wktórymzachodziła
elektroorezanamembranpolimerową.Migracjabiałeknatpujewroztworze buforowym. Ujem-
nienaładowanecząteczkiprzechodzązżelu,podwpływemprzyłożonegonapicia,wkierunkudo-
datniejelektrodyizotajązatrzymanenamembraniedająclutrzanyobrazrozdzielonychwczeniej
polipeptydów.Wzytkotopoto,żebyułatwićidentyikacjbiałek.
Membrana zbudowana jest z PVDF czyli fluorku poliwinylidenu (polifluorku
winylidenu?) przedstawionego obok. Jest to polimer o wysokim stopniu krystalizacji,
dobrychwłanociachmechanicznych,cieplnychielektrycznychorazodużej odpor-
nocichemicznej.
intrukcjadoćwiczenia,wikiPrzedrozpoczciemelektrotranerunależy
membranaktywowaćabymogłyinaniejoadzićbiałka.Pozakończeniutranerumembran
blokujeiuniemożliwiającłączenieiprzeciwciałzamąmembraną.
1.3.
Immunobarwienie
Pozablokowaniumembranyprzeprowadzaiznakowaniebiałekznajdującychinaniejan-
tygenamilubbarwnikamipozwalającyminauwidocznienieintereującychnabiałek.
pozwalającą na wysoce selektywne barwienie białek i peptydów przy zastosowaniu przeciwciał zna-
Strona
2
z
3
JedynienawewntrznyużytekkierunkuInżynieriaBiomedyczna,MSIB,GH.
    ©MikołajGołuńki
kowanych fluorescencyjnie, enzymatycznie lub radioizotopowo. Przygotowuje si przeciwciała dla
białek, które chcemy zobaczyć. Doczepia si do nich grup fluorescencyjną a nastpnie wpuszcza si
je na membran. Przeciwciała łączą si tylko ze specyficznymi białkami barwiąc je w ten sposób.
2.
I
NNE
2.1.
Bibuła Whatmana
Bibuła chromatograficzna dostarczona przez firm Whatman
2.2.
TG – Tris-Glycine
Rodzaj buforowego żelu poliakrylamidowego.
2.3.
Kazeina
Białko z mleka ssaków.
2.4.
TBS – Tris-buffered saline
Kolejny bufor. Utrzymuje odczyn zasadowy.
2.5.
Biotynylowanie
Chyba podczepianie do czego cząsteczki biotyny. Biotyna (witamina H lub B
7
) to związek cy-
kliczny, koenzym wielu enzymów.
2.6.
Streptawidyna
winowactwie do biotyny.
2.7.
Fosfataza alkaliczna
Enzym z klasy hydrolaz (co to hydrolaza w czci o amylazie).
2.8.
Homogenizator mechaniczny
w rodzaju miksera/blendera. Służy do rozdrobienia i rozerwania materiału poprzez utarcie go midzy
łopatkami rotora o ciankami statora (rury, w której znajduje si rotor).
2.9.
Aceton lodowaty
Najpewniej aceton zmrożony do bardzo niskiej temperatury (można uzyskać aceton o tempe-
raturze -78°C przy użyciu zimnego lodu – stałego dwutlenku wgla).
2.10.
Eppendorf
Rodzaj plastikowej probówki jednorazowej. Taka mała, ze zwżającym si dołem
i zamkniciem „na wcisk”. Pokazana jest obok.
Strona
3
z
3
JedynienawewntrznyużytekkierunkuInżynieriaBiomedyczna,MSIB,GH.
            [ Pobierz całość w formacie PDF ]