[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->Blood Minizestaw do izolacji DNA z krwinumery katalogowe 022-50, 022-250ProtokółProtokół izolacji DNA1. Dodać 200μluniwersalnego buforu lizującego LT i 20μlProteinazy K. Całośćwymieszać i inkubować 20 min. w temperaturze 37° Cv.0911Protokółv.09112.3.4.5.6.7.8.WstępZestaw opiera się na zdolności wiązania się DNA do złó krzemionkowych w wysokichstę eniach soli chaotropowych.Krew lizowana jest w odpowiednim buforze lizującym, któryzawiera sole chaotropowe i detergenty niejonowe (bufor LT). Dodatkowo w procesie lizyuczestniczy silna proteaza (Proteinaza K). W tych warunkach dochodzi do lizy komóreki degradacji wszelkich białek. Następnie mieszanina nanoszona jest na minikolumnęze specjalnym zło em krzemionkowym. DNA przechodząc przez zło e osiada na nim,podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą nie zwiazane. Po wypłukaniu z kolumny resztekzanieczyszczeń, oczyszczone DNA wymywane jest z niej niskojonowymi buforami lub wodą inadaje się do bezpośredniego wykorzystania bez konieczności precypitacji.Uwagi1. Zestaw przeznaczony jest do izolacji DNA z 0.1-1 ml krwi świe ej lub mro onej.Pojemność minikolumny do oczyszczania DNA wynosi 20μg.2. Proteinaza K znajdująca si∏ w zestawie jest roztworem gotowym do u ycia, który, nale yprzetrzymywać w temperaturze 2-8°C. Data wa ności znajduje si∏ na etykietce.3. Jezeli roztwór LT zawiera precypitat nale y go podgrzać do temperatury 40°C w celucałkowitego rozpuszczenia osadu przed u yciem.Przygotowanie materiałuA. 100μlkrwi świeżej lub mrożonej1. Pobrać do probówki 100μlkrwi świe ej lub mro onej. W przypadku mniejszychobjętości krwi dodać buforu Tris do całkowitej objętości 100μl.2. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA.B. 0.2-1 ml krwi świeżej lub mrożonej1. Pobrać do probówki odpowiednią ilość krwi i dodać połowę objętości roztworulizującego erytrocyty LE (np. do 500μlkrwi dodać 250μlroztworu LE)2. Całość wymieszać przez odwracanie probówki, a roztwór z mętnego zmieni się wszkarłatnie przezroczysty.3. Próbkę wirować trzy minuty przy 10-15 tys. RPM4. Po wirowaniu usunąć pipetą supernatant, a do osadu stanowiącego frakcję białychkrwinek dodać 100μlbuforu Tris i dokładnie zawiesić go przez pipetowanie.5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNAUwaga!Metodę A przygotowania materiału stosować można tylko do próbek krwi świeżej i mrożonej doodjętości 100μl.. Do próbek krwi świeżej i mrożonej do odjętości do 1 ml należy stosować metodę B. Wprzypadku większych objętości próbek krwi zalecamy zastosowanie odrębnych zestawów A&A Biotechnology:Dla próbek o objętości 1-2 ml - Genomic Midi AX (nr. kat 895-20) zaś dla próbek 2-5 ml, Genomic Maxi AX (nr.kat 995-10)Próbkę intensywnie worteksować 20 sek. i nanieść na minikolumnę do oczyszczaniagenomowego DNA.Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.Wyjąć minikolumnę wraz z probówką i dodać 500μlroztworu płuczącego A1.Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.Przenieść minikolumnę do nowej probówki 2 ml (w zestawie) i dodać do kolumny 400μlroztworu płuczącego A1.Wirować 2 min. przy 10-15 tys. RPM.Osuszoną minikolumn∏ umieścić w nowej probówce 1.5 ml i dodać do niej 100 lub 200μlbuforu Tris (10mM TRIS.HCl pH 8.5).Uwaga!W przypadku izolacji DNA ze 100μlkrwi nale y dodać 100μlbuforu elucyjnego (Tris), Natomiastw przypadku izolacji z większej objętości należy dodać 200μlbuforu elucyjnego.9.Inkubować próbkę 5 min. w temperaturze pokojowej10. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.11. Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce przetrzymywaćw lodówce do czasu dalszych analiz.A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Polandtel +48587351194, fax +48586228578, www.aabiot.com, info@aabiot.com01A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Polandtel +48587351194, fax +48586228578, www.aabiot.com, info@aabiot.com02 [ Pobierz całość w formacie PDF ]