[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->Tom 582009Numer 1–2 (282–283)Strony113–125JacekBłażewicz, PiotrłukasiakInstytut InformatykiPolitechnika PoznańskaPiotrowo 2, 60-965 PoznańInstytut Chemii Bioorganicznej PANNoskowskiego 12/14, 61-704 PoznańE-mail: Jacek.Blazewicz@cs.put.poznan.plPiotr.Lukasiak@cs.put.poznan.plsYsteM wsPoMaGaNia wYtwarzaNia i aNaLiz szczePioNek GeNetYczNYcHWSTĘPWynalezienie szczepionek i związany ztym rozwój szczepień ochronnych był prze-łomowym momentem w dziejach ludzkiejcywilizacji i jednym z najważniejszych osią-gnięć nowożytnej medycyny. Pierwsze udo-kumentowane próby przeciwdziałania za-chorowalności na choroby zakaźne pojawiłysię już w Chinach w X w., gdzie wcieranomałym dzieciom w błonę śluzową nosa utłu-czone na proszek strupy po ospie. W Indiachrównież stosowano podobną profilaktykę,polegającą na zakładaniu dzieciom ubrań pochorych na ospę lub wkłuwano igły zakażo-ne ropą pobraną od chorych. Nieco później,w Turcji, niewolnicom przeznaczonym doharemów, za pomocą małego nożyka robiononacięcie i wprowadzano odrobinę ropy z pę-cherzy ospowych. Usystematyzowane szcze-pienia przeciw ospie prawdziwej, polegającena nakłuwaniu żyły igłą uprzednio zanurzonąw ospowatej ropie, wkraczają do Europy wXVIII w. Metoda ta nosi nazwę wariolizacji(łac.variola vera— ospa prawdziwa). Jed-nak obecna nazwa dziedziny nauk medycz-nych, zajmującej się szczepieniami ochron-nymi, zwanej wakcynologią, pochodzi odeksperymentów wykonanych przez EdwardaJennera podczas badań nad ospą prawdziwą,który wykorzystał powszechne przekonanie,iż osoba, która zapadła i przeszła tzw. ospękrowiankę (łac.variola vaccina),nie zacho-ruje już na ospę prawdziwą. Aczkolwiek tebadania były wykonywane świadomie, jed-nak przeprowadzane one były bez znajomo-ści podstaw immunologicznych tych zjawisk.Sformułowanie ogólnych praw związanychze szczepieniami, jak i odkrycie metody „od-zjadliwiania” bakterii, zostało po raz pierw-szy dokonane przez Ludwika Pasteura podkoniec XIX w., który wynalazł szczepionkęm.in. przeciwko wąglikowi, różycy i wście-kliźnie. Od tego momentu możemy mówićo powstaniu immunologii (JakóBisiak2002).Przez cały XX w., na całym świecie naukow-cy intensywnie pracowali nad stworzeniemszczepionek przeciw różnego rodzaju bakte-riom, jednak pomimo ich wysiłków, w kilkuprzypadkach uwieńczonych pełnym sukce-sem, nadal istnieje wiele wirusów, przeciw-ko którym ludzkość z jej obecnym stanemwiedzy jest bezsilna. Dzięki szczepieniomochronnym człowiek opanował już wielechorób zakaźnych. Są nimi: odra, ospa, tężec,tyfus, choroba Heinego-Medina, wirusowezapalenie wątroby typu A i B (ertL1996).Od końca XX w. postęp w dziedzinie naukbiologicznych został połączony z rozwojemnauk ścisłych wspomaganym przez corazbardziej zaawansowane maszyny obliczenio-we. Wynikiem tego mariażu jest nauka zwa-na bioinformatyką, która coraz wyraźniej za-znacza swoje istnienie również w dziedzinieimmunologii. Pojawienie się coraz bardziejodpornych wirusów charakteryzujących się114JacekBłażewicz, Piotrłukasiaknp. hiperzmiennością antygenową i oddziały-waniem z układem odpornościowym (HIV),które umykają prostym analizom powoduje,iż wspomaganie procesów opracowywanianowych szczepionek za pomocą nauk obli-czeniowych, umożliwiających szybką i peł-ną analizę ogromnej ilości danych, staje sięniezbędnym warunkiem przetrwania rodzajuludzkiego.RODZAJE SZCZEPIONEKSzczepionka zawiera w sobie martwe lubosłabione patogeny lub ich fragmenty. Pato-geny, to czynniki chorobotwórcze (np. wi-rusy, bakterie, pasożyty). Gdy do organizmuczłowieka dostanie się odpowiednia „dawka”patogenów w formie szczepionek, układ od-pornościowy uczy się walczyć z takim pato-genem, by na przyszłość nie zostać zaskoczo-nym i umieć się obronić. Zależnie od tego,jakie zostaną użyte patogeny, taka zostaniepobudzona odpowiedź immunologiczna (Ja-kóBisiak2002).Każda szczepionka dopuszczona do stoso-wania powinna spełniać szereg określonychwymagań (Piekarowicz2004):— powinna zapobiegać chorobie, a nieko-niecznie zakażeniu;— nabyta odporność, najlepiej po jednorazo-wym podaniu szczepionki, powinna trwaćjak najdłużej, najlepiej przez całe życie;— indukcja właściwej dla danego typu wirusaodpowiedzi immunologicznej, która powin-na być tego samego typu, jak występująca wczasie zakażenia dzikim typem wirusa;— szczepionka powinna wywoływać minimal-ne objawy uboczne’Szczepionka powinna też charakteryzo-wać się stabilnością, szczególnie niewrażliwo-ścią na podwyższoną temperaturę, łatwościątransportu i przechowywania, jak równieżprostym sposobem podania.Szczepionki konwencjonalne dzieli się natrzy podstawowe grupy:— szczepionki zawierające żywe atenuowane(unieszkodliwione) wirusy,— szczepionki zwierające zabite wirusy,— szczepionki podjednostkowe, w którychskład wchodzą specjalne białka wirusowe lubich części.Jednak szczepionki konwencjonalne mająswoje wady:— nie zawsze są skuteczne; są choroby, naktóre szczepionki nie działają;— szczepionki mogą nie aktywować wystar-czającej odpowiedzi immunologicznej;— odporność może być krótkotrwała, wów-czas szczepienie trzeba powtarzać co jakiśczas;— mogą być niebezpieczne, dlatego, że groź-ny, osłabiony patogen (np. wirus), użyty wszczepionce, może ulec mutacji i zaatakowaćorganizm;— mogą wywoływać alergię lub być szkodli-we dla organizmu przez zawarte w nich za-nieczyszczenia i niepotrzebne substancje (Ja-kóBisiak2002).SZCZEPIONKI GENETYCZNETerapia genowa jest stosowana u ludziod zaledwie 10 lat. Przełomem było użycieodpowiednio spreparowanych wirusów, jakoposłańców wprowadzających do komórkigeny lecznicze, które zastępowały jej własneuszkodzone geny albo przydawały jej jakąśistotną cechę (np. aby była rozpoznawanaprzez układ immunologiczny). Cały procesodbywa się zazwyczajin vitro,czyli pozaustrojem człowieka, później zaś takie napra-wione komórki wstrzykiwane są do ludzkie-go organizmu (Belakova 2007).Niezwykleinteresująceperspektywystwarzają szczepionki genetyczne, które będązmuszać DNA do produkcji odpowiednichbiałek, wywołujących odporność. Wstępnepróby na myszach dały bardzo obiecującewynik, nawet wobec charakteryzujących sięszybkimi mutacjami wirusów grypy (scHNe-ideriMoHr2003).Wirusowe systemy transferu genów wy-korzystują unikatowe, biologiczne właści-wości wirusów. W normalnych warunkachwe wnętrzu otoczki wirusów znajduje sięich własny materiał genetyczny w postaciDNA lub RNA. Wirus wnikając do komórkidocelowej uwalnia swój materiał genetycz-ny, który służy jako matryca do produkcjikolejnych wirusów (replikacja). Zainfeko-wana komórka powiela materiał genetycznySystem wspomagania wytwarzania i analiz szczepionek genetycznych115wirusa, syntetyzuje jego białka strukturalne,a następnie składa kolejne kompletne czą-steczki patogenu. Wirusowe systemy trans-feru genów to rekombinowane wirusy za-wierające wewnątrz otoczki sekwencje te-rapeutyczne, które zastępują geny kodującesamego wirusa. Idealny, wirusowy systemtransferu genów powinien charakteryzowaćsię takimi cechami jak: wysokie miano (licz-ba cząsteczek rekombinowanego wirusa wjednostce objętości), prosty system produk-cji, możliwość dostarczania materiału gene-tycznego o dużych rozmiarach, precyzyjnei stabilne wprowadzenie genu terapeutycz-nego, brak immunogenności (HoffMaNiwspółaut. 1997). Cały czas trwają prace nadudoskonaleniem istniejących wirusowychsystemów transferu genów, które charak-teryzowałyby się wszystkimi wyżej wymie-nionymi cechami. Aktualnie nie dysponujesię jednym uniwersalnym nośnikiem wiru-sowym, a powyższe cechy charakteryzująróżne systemy wektorów (nośników) (Pe-acHMaNi współaut. 2003).Być może szczepionki tradycyjne nigdynie będą w stanie poradzić sobie zarównoz grypą, jak i innymi chorobami zakaźnymi.Dlatego też od początku lat 90. naukow-cy pracują nad szczepionkami genowymi.Pierwsze próby kliniczne przeprowadzonow 1995 r., kiedy to plazmid zawierającygen HIV podano pacjentom już zarażonym(costai współaut. 1998). Obecnie przepro-wadza się badania nad szczepionkami mo-gącymi zapobiegać zakażeniom (np. HIV,wirusów opryszczki, grypy, wirusowegozapalenia wątroby typu B, malarii), mogą-cymi wzmacniać osłabioną odporność cho-rych zakażonych HIV i leczyć nowotwory.Z patogenu pobiera się jeden lub kilka ge-nów, które kodują antygeny (białko, któreorganizm może rozpoznać i uznać za „wła-sne” bądź „cudze”, w tym drugim przypad-ku dając sygnał do zniszczenia patogenuz tym antygenem). Geny te włącza się wplazmidy, koliste cząsteczki DNA pobraneod nieszkodliwych bakterii. Spełniają onerolę wektorów (cząsteczek-przenośników),które transportują włączone w nie geny dokomórek ciała ludzkiego (reYes-saNdovaLiertL2001). By wprowadzić szczepionkędo organizmu, używa się strzykawek, pi-stoletów genowych, aerozolu bądź kroplido nosa (daNkoiwoLff1994). Najczęściejbadania dotyczące szczepionek DNA pro-wadzi się przez wstrzyknięcie domięśnio-we (DNA rozpuszczone w roztworze solifizjologicznej) lub śródskórne. Stosuje sięteż kompleksy DNA-lipid, które w podaniudożylnym wykazują większą ekspresję (pro-dukcję antygenów) niż w podaniu domię-śniowym. W ostatnim czasie zaczęto poda-wać DNA w formie aerozolu i uznano, żenajlepsze wyniki uzyskuje się przy wyko-rzystaniu ich do leczenia chorób dróg od-dechowych. Kolejnym sposobem jest poda-wanie kulek złota mikroskopijnej wielkości,opłaszczonych DNA (metoda „gene gun”)(MaNoJi współaut. 2004).Szczepionki genetyczne charakteryzują sięnastępującymi cechami (koftaiwędrYcHo-wicz2001):— wywołują silną odpowiedź immunologicz-ną;— są bezpieczne — nie niosą zagrożenia zestrony patogenu — do plazmidu wprowadzasię tylko geny odpowiedzialne za produkcjęantygenów; brak jest tam genów mogącychodtworzyć patogen — czynnik chorobotwór-czy, zarażający organizm;— są przydatne w uodparnianiu niemowląt —zawodzą tu tradycyjne szczepionki, gdyż im-munoglobuliny pochodzące od matki wiążądrobnoustroje ze szczepionek, hamując moż-liwość rozwinięcia się odpowiedzi immuno-logicznej (sieGrist1997);— mogą zapewnić odporność przeciwko kil-ku szczepom patogenów jednocześnie, jeżelido plazmidu wszczepi się geny pochodząceod różnych szczepów patogenów;— są w stanie wywołać zarówno odpowiedzkomórkową jak i humoralną;— są silnie immunogenne — mogą pobudzićmechanizmy odpornościowe, odmienne odnaturalnej odpowiedzi immunologicznej;— antygen powstający w organizmie immu-nizowanego osobnika jest identyczny do na-tywnego białka patogenu;— DNA jest trwałe i termostabilne — nie wy-maga utrzymywania niskich temperatur pod-czas transportu i przechowywania.Do tej pory naukowcy nie udowodnili in-gerencji szczepionek genetycznych w genomludzki jak również nie stwierdzono u czło-wieka żadnych zmian patologicznych powsta-łych w wyniku ich stosowania.Badania nad szczepionkami z DNA za-częły się niedawno. Naukowcy oceniają, jakdziałają one na układ odpornościowy — sku-teczność szczepionek genowych w leczeniui zapobieganiu chorobom jest dopiero ba-dana. Badacze z jednej strony mają nadzie-ję, że wprowadzenie plazmidowego DNAdo komórki będzie utrzymywać długotrwa-116JacekBłażewicz, Piotrłukasiakłą i wysoką odpowiedź immunologiczną, zdrugiej jednak strony obawiają się, czy niedoprowadzi to do autoagresji (ataku na wła-sne komórki). Istnieje również obawa, iżplazmidowy DNA mógłby wbudować się dokomórek gospodarza. W badaniach na zwie-rzętach nie stwierdzono jednak wystąpieniaefektów ubocznych. Udowodniono nato-miast, że stosowanie szczepionek DNA jestwysoce skuteczne — wywołują one bowiemsilną odpowiedź immunologiczną, chroniącprzed późniejszymi infekcjami: wzw typu Bi C, AIDS, opryszczką, grypą, wścieklizną,malarią (roGaNiBaBiuk2005).SYSTEM WSPOMAGANIA WYTWARZANIA SZCZEPIONEKWychodząc naprzeciw bieżącym potrze-bom immunologii i wakcynologii, w ra-mach projektu CompuVac realizowanegow 6. Programie Ramowym Komisji Europej-skiej, zespół Instytutu Informatyki Politech-niki Poznańskiej podjął próbę usystematy-zowania procesu wytwarzania szczepionekgenetycznych poprzez stworzenie systemuwspomagania ich wytwarzania — GeVaDSs(ang. Genetic Vaccine Decision Supportsystem) (Błażewiczi współaut. 2006, 2008;łukasiaki współaut. 2007). KonsorcjumCompuVac, koordynowane przez GroupeHospitalier Pitié-Salpétrière, Université Pier-re et Marie Curie w Paryżu, skupia 18 in-stytucji naukowych i komercyjnych. ZespółInstytutu Informatyki Politechniki Poznań-skiej jest jedynym laboratorium bioinfor-matycznym pracującym w ramach konsor-cjum.System GeVaDSs składa się z 7 modułów(Ryc. 1), z których każdy stanowi istotnączęść analizy odpowiedzi immunologicznejukładu odpornościowego.Fundamentem stworzenia tego systemubyła idea, aby w jednym miejscu zgrupo-wać wszystkie wyniki badań prowadzonychrównolegle przez różne laboratoria, umoż-liwiając następnie ich analizę za pomocązaawansowanych narzędzi statystycznych iwizualizacyjnych. Zrealizowanie tego zamia-ru pozwoliło na stworzenie pełnego obrazu,jaką odpowiedź immunologiczną ma danywektor, umożliwiając już na tym etapiepominięcie tych kierunków badań, czy teżtakich kombinacji wstrzyknięć antygenów,które nie rokują pozytywnych wyników.System ten może stać się bardzo istotnympunktem odniesienia również dla badańwykonywanych w przyszłości, gdyż pozwo-li na porównanie odpowiedzi immunolo-gicznej nowych wektorów z wektorami jużwcześniej przeanalizowanymi. Pozwoli onrównież na jednoznaczne określenie, któryz wektorów wywołuje odpowiedzi immu-nologiczne danego typu. Do opisu ekspery-mentów immunologicznych wybrana zosta-ła informacja o odpowiedzi komórkowej,Ryc. 1 Schemat systemu GeVaDSs.humoralnej oraz sygnaturze molekularnejrozumianej jako poziom ekspresji genów.HIERARCHIA WEKTORÓWGłównym, a w zasadzie kluczowym ele-mentem systemu było stworzenie hierarchiiwektorów w oparciu o ich cechy biologicz-ne (Ryc. 2).W wyniku tych działań powstała jedno-znaczna hierarchia wektorów, dzięki którejbardzo łatwo i szybko może zostać znalezio-ny poszukiwany wektor lub ich rodzina. Każ-dy z wektorów ma ustandaryzowany opis,zawierający szczegółową o nim informację,tj. producent, kategoria, sposób produkcji,informację o antygenie oraz jakiego typu od-powiedź immunologiczną wywołuje.System pozwala na podgląd zarównodrzewa, jak i kategorii utworzonych wekto-rów (Ryc. 3).PROTOKÓŁ IMMUNIZACJIKolejnym kluczowym elementem syste-mu była standaryzacja protokołu immuni-zacji zawierającego szczegółową proceduręSystem wspomagania wytwarzania i analiz szczepionek genetycznych117immunizacji użytą podczas eksperymentów.Informacje dotyczące protokołu immunizacjidotyczą liczby wstrzyknięć, dnia w którymdane wstrzyknięcie zostało wykonane, co jestszczególnie istotne przy immunizacji wielo-etapowej, metody wprowadzenia szczepionkido organizmu, rodzaju wektora oraz dawkiantygenu (Ryc. 4).ANALIZA ODPORNOŚCI KOMÓRKOWEJRyc 2. Hierarchia wektorów.Odporność komórkowa jest związanagłownie z aktywnością limfocytów T, działają-cych z udziałem limfocytów cytotoksycznych(ang. T cytotoxic lymphocyte, CTL) i pomoc-niczych limfocytów T CD4+. Komórki CTLrozpoznają antygeny wirusowe obecne napowierzchni komórek w kompleksie z wy-branymi białkami, co prowadzi do eliminacjizainfekowanych komórek zanim dojdzie wnich do namnożenia się i uwolnienia cząstekwirusowych. Mechanizm rozpoznania takichkomórek zależy od tego, czy antygeny wiru-sowe staną się zdolne do wytworzenia kom-pleksu ze składnikami białek i przeniesieniugo do błony komórkowej. Limfocyty pomoc-nicze T CD4+ stanowią również ważny ele-ment systemu obronnego wpływając na two-rzenie systemu zapalnego w odpowiedzi nainfekcję wirusową. Limfocyty pomocnicze Tstymulują następnie proliferację komórek Bdostarczających immunoglobin związanychz odpowiedzią humoralną. Zdolność do wy-wołania takiej odpowiedzi zależy od rodzajuRyc. 3. Podgląd listy wektorów. [ Pobierz całość w formacie PDF ]